Teses

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Aladim Fernandes Gomes Júnior

Tiago Antônio da Silva Brandão

Análise do Espectro de Ação e Mecanismo de Catálise da Salicilato Hidroxilase

Analysis Of The Substrate Scope And Catalytic Mechanism Of Salicylate Hydroxylase

Química

Macromoléculas e Materiais

 

13/07/2026

meet.google.com/kwr-mwrh-mjb

13:30

Prof. Tiago Antônio da Silva Brandão - Orientador (Dr. (UFMG))
Prof. Adolfo Henrique de Moraes Silva - Coorientador (Dr. (UFMG))
Prof. Hernán Francisco Terenzi (Dr. (UFSC))
Profa. Mariana Torquato Quezado de Magalhães (Dr. (IME))
Profa. Amanda Silva de Miranda (Dr. (UFMG))
Prof. Jarbas Magalhães Resende (Dr. (UFMG))

A salicilato hidroxilase (NahG, EC 1.14.13.1) é uma flavoproteína monoxigenase dependente de FAD envolvida na degradação microbiana de compostos aromáticos, catalisando a descarboxilação oxidativa do salicilato a catecol por meio de uma reação de hidroxilação ipso mediada por um intermediário C4a-hidroperoxiflavina. No entanto, diversos aspectos relacionados ao seu espectro de ação, mecanismo catalítico e eficiência de acoplamento permanecem pouco compreendidos. Neste trabalho, foi realizada uma análise abrangente do espectro de ação e do mecanismo de catálise da NahG empregando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cinética enzimática, relações lineares de energia livre, experimentos fotoenzimáticos e determinações de efeitos isotópicos cinéticos por RMN quantitativa de 13C. A investigação sistemática de substratos estruturalmente relacionados ao salicilato contendo grupos amida, hidroxamato, éster, aldeído e cetona demonstrou que a substituição do grupo carboxilato modula significativamente a eficiência catalítica e o resultado da reação. Com exceção do salicilato de metila, todos os substratos avaliados sofreram clivagem da ligação aril-carbonila após a hidroxilação aromática, conduzindo à formação de catecol como produto aromático comum. Esses resultados revelam uma reatividade de decarbonilação sem precedentes conhecidos entre monoxigenases dependentes de flavina e demonstram que a NahG apresenta um espectro de ação significativamente mais amplo do que previamente reconhecido. As análises cinéticas mostraram que a afinidade aparente pelos substratos está relacionada ao estado de protonação do grupo fenólico orto, enquanto a eficiência catalítica apresenta forte dependência das propriedades eletrônicas dos substituintes carbonílicos. Relações lineares de energia livre demonstraram que a transferência eletrônica envolvida na redução do cofator flavínico constitui uma etapa fortemente modulada pelos efeitos eletrônicos do substrato, estabelecendo o comprometimento catalítico antes da ativação do oxigênio molecular. Em contraste, a dependência relativamente fraca dos valores de kcat em relação aos parâmetros eletrônicos sugere que a velocidade global observada é influenciada predominantemente por eventos oxidativos subsequentes. A determinação simultânea do consumo de substrato e NADH por RMN de 1H permitiu quantificar a extensão das reações desacopladas para diferentes substratos, demonstrando que a eficiência de acoplamento catalítico depende significativamente da natureza do grupo substituinte. Os resultados evidenciaram que uma fração substancial dos equivalentes redutores pode ser desviada para vias improdutivas, resultando na formação de peróxido de hidrogênio e reduzindo a eficiência global da conversão catalítica. Com o objetivo de substituir o NADH como fonte de elétrons, foram desenvolvidos sistemas fotoenzimáticos baseados na fotorredução de FAD e riboflavina utilizando EDTA como doador de elétrons de sacrifício. Conversões significativas foram obtidas sob irradiação com LED azul, demonstrando a viabilidade da utilização de flavinas fotoexcitadas para sustentar a atividade catalítica da NahG. Entretanto, a quantificação de H2O2 revelou a ocorrência de extensas reações desacopladas, indicando que estratégias adicionais de remoção de espécies reativas de oxigênio serão necessárias para futuras aplicações fotoenzimáticas. Por fim, experimentos preliminares de determinação de efeitos isotópicos cinéticos de 13C em abundância natural por RMN quantitativa forneceram resultados compatíveis com a participação dos carbonos do grupo carboxilato e da posição C2 em etapas próximas ao estado de transição determinante da velocidade da reação. Embora ainda limitados pelas incertezas experimentais, esses resultados mostraram-se consistentes com a hipótese mecanística proposta e com as tendências observadas nas análises de relações lineares de energia livre. Em conjunto, os resultados obtidos demonstram que a redução da flavina constitui uma etapa de comprometimento catalítico eletronicamente modulada, enquanto a decarbonilação representa uma característica intrínseca da catálise promovida pela NahG. Além de ampliar significativamente o repertório químico conhecido das flavoproteínas monoxigenases, este trabalho estabelece novas bases mecanísticas para a utilização de enzimas dependentes de flavina em transformações seletivas envolvendo clivagem de ligações carbono-carbono.

cinética enzimática, decarbonilação, descarboxilação oxidativa, flavoproteínas monoxigenases, salicilato hidroxilase

Salicylate hydroxylase (NahG, EC 1.14.13.1) is a FAD-dependent flavin monooxygenase involved in the microbial degradation of aromatic compounds, catalyzing the oxidative decarboxylation of salicylate to catechol through an ipso-hydroxylation reaction mediated by a C4a-hydroperoxyflavin intermediate. However, several aspects of its substrate scope, catalytic mechanism, and coupling efficiency remain poorly understood. In this work, a comprehensive analysis of the substrate scope and catalytic mechanism of NahG was carried out using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, enzyme kinetics, linear free-energy relationships, photoenzymatic experiments, and kinetic isotope effect determinations by quantitative 13C NMR. A systematic investigation of salicylate-derived substrates containing amide, hydroxamate, ester, aldehyde, and ketone functionalities demonstrated that replacement of the carboxylate group significantly modulates both catalytic efficiency and reaction outcome. With the exception of methyl salicylate, all substrates underwent aryl-carbonyl bond cleavage following aromatic hydroxylation, yielding catechol as a common aromatic product. These findings reveal a decarbonylation reactivity with no known precedent among flavin-dependent monooxygenases and demonstrate that NahG possesses a substantially broader substrate scope than previously recognized. Kinetic analyses showed that apparent substrate binding is related to the protonation state of the ortho-phenolic group, whereas catalytic efficiency exhibits a strong dependence on the electronic properties of the carbonyl substituent. Linear free-energy relationships demonstrated that electron transfer associated with flavin reduction constitutes a step strongly modulated by substrate electronics, establishing catalytic commitment prior to molecular oxygen activation. In contrast, the relatively weak dependence of kcat on substituent electronic parameters suggests that the overall turnover rate is predominantly influenced by subsequent oxidative events. Simultaneous quantification of substrate and NADH consumption by 1H NMR allowed the extent of uncoupled reactions to be determined for different substrates, demonstrating that catalytic coupling efficiency depends significantly on substituent identity. These results revealed that a substantial fraction of reducing equivalents may be diverted to unproductive pathways, leading to hydrogen peroxide formation and decreasing the overall efficiency of substrate conversion. In an effort to replace NADH as the electron source, photoenzymatic systems based on the photoreduction of FAD and riboflavin using EDTA as a sacrificial electron donor were developed. Significant substrate conversions were achieved under blue LED irradiation, demonstrating the feasibility of employing photoexcited flavins to sustain NahG activity. However, quantitative determination of H2O2 revealed extensive uncoupled reactivity, indicating that additional strategies for reactive oxygen species removal will be required for future photoenzymatic applications. Finally, natural-abundance 13C kinetic isotope effect experiments performed by quantitative NMR provided results consistent with the participation of the carboxylate carbon and the C2 position in steps occurring near the rate-determining transition state. Although still limited by experimental uncertainty, these results are consistent with the proposed catalytic mechanism and with the trends observed in the linear free-energy analyses. Collectively, the results demonstrate that flavin reduction constitutes an electronically modulated catalytic commitment step, whereas decarbonylation represents an intrinsic feature of NahG catalysis. Beyond significantly expanding the known chemical repertoire of flavin-dependent monooxygenases, this work establishes new mechanistic foundations for the use of flavin-dependent enzymes in selective carbon-carbon bond cleavage transformations.

decarbonylation, enzyme kinetics, flavin-dependent monooxygenases, oxidative decarboxylation, salicylate hydroxylase