Dissertações

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Leandro de Oliveira da Cunha

Thiago Teixeira Tasso

Caracterização de Produtos de Fotooxidação Lipídica Em Membranas Miméticas Gerados Pela Fotossensibilização Com Porfirazinas

Characterization Of Lipid Photooxidation Products In Model Membranes Induced By Porphyrazine Mediated Photosensitization

Química

Química Medicinal e Biologia Química

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05/08/2025

Sala de ConferênciaWeb

14:00

Prof. Thiago Teixeira Tasso - Orientador (Dr. (UFMG))
Profa. Tayana Mazin Tsubone (Dr. (UFU))
Prof. Adolfo Henrique de Moraes Silva (Dr. (UFMG))

Desde o primeiro relato feito por Thomas J. Dougherty em 1974, (1) a terapia fotodinâmica (TFD) evoluiu consideravelmente para se tornar um protocolo médico consolidado por diversas agências de regulamentação. Atualmente, esse procedimento é prescrito para tratamento de inúmeras enfermidades, tais como diversos tipos de câncer, pé diabético, acne inflamatória, degeneração macular, entre outros. (2) A TFD utiliza-se de um fotossensibilizador (FS) capaz de gerar espécies reativas quando na presença de oxigênio e luz visível. Tais espécies são responsáveis por oxidar biomoléculas e consequentemente induzir a morte celular. (3) Durante o processo de fotossensibilização, os lipídeos que constituem as membranas são os principais alvos de oxidação, uma vez que essas estruturas representam a primeira barreira de entrada em células e organelas. Um estudo prévio mostrou que duas porfirazinas (Pzs) contendo os substituintes 3-trifluorometilfenil (3-CF3Pz) e 4-fluorofenil (4-FPz) apresentaram eficiência semelhante de produção de espécies reativas, porém demonstraram uma nítida diferença na eficiência de permeabilização de membranas miméticas. Tal diferença indica uma possível propriedade presente em um destes compostos que favorece o dano celular, todavia ainda não elucidada. Dito isso, o principal objetivo desta tese é comparar a eficiência fotodinâmica das porfirazinas 3-CF3Pz e (4-FPz), por meio da identificação dos tipos de espécies radicalares e produtos formados durante o processo de fotooxidação lipídica. Para isso, as Pzs foram veiculadas em lipossomos de 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), di-oleil-fosfatidilcolina (DOPC) e fosfatidilcolina de soja (SOY 95%), na proporção de 0,5 mol% de FS e foram excitadas por diferentes fontes luminosas na região do vermelho a depender do experimento. Os ensaios para a detecção de espécies reativas foram feitos com espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e os produtos de fotooxidação lipídica foram caracterizados por espectrometria de massas e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG-MS). Foi analisada também a eficiência fotodinâmica dos compostos tanto em membranas miméticas, por meio do ensaio de vazamento de membrana acompanhado por medidas de fluorescência, quanto in vitro, utilizando-se ensaios de viabilidade celular (MTT) para as linhagens celulares HaCaT e A-431. Por fim, realizou-se um estudo conformacional e uma caracterização espacial dos compostos em membrana por meio de cálculos teóricos realizados no GROMACS. Quando carreados em lipossomos, observou-se que a 3-CF3Pz apresentou atividade fototóxica muito maior (IC50 = 0,23 uM) contra a A431 (linhagem tumoral) quando comparada a 4-FPz (IC50 = 0,83 uM), apesar dos dados de EPR não demonstrarem uma diferença significativa na produção de espécies reativas de oxigênio . Estes dados estão em concordância com os dados do experimento de vazamento de membrana, no qual, após 30 minutos de irradiação, a permeabilização da 3-CF3Pz chegou a 96% contra apenas 16% da 4-FPz. Os resultados de ESI-MS indicam que a produção de lipídeos hidroperoxidados para ambas as Pzs também são similares, todavia os resultados cromatográficos indicam que a 4-FPz possui uma eficiência maior na formação de ácidos graxos enquanto a 3-CF3Pz apresenta um sinal correspondente a um aldeído lipídico, espécie responsável pela permeabilização de membranas. Os dados de dinâmica molecular corroboram com os resultados de CG-MS, visto que, nas simulações a 4-FPz tende a se localizar na parte hidrofílica das moléculas lipídicas, possibilitando reações que tendem a formar ácido graxo, enquanto a 3-CF3Pz se difunde pela membrana até a região mais lipofílica da membrana onde se concentram as insaturações lipídicas. De acordo com a literatura, reações na insaturação que resultam em clivagem da cadeia carbônica induzem a formação de poros em membranas, o que justifica a maior eficiência fototóxica da 3-CF3Pz. Diante do exposto, conclui-se que há uma diferença significativa de fototoxicidade entre as Pzs, que pode estar associada à formação de lipídeos de cadeia curta, como aldeídos lipídicos, proveniente do posicionamento assumido pela 3-CF3Pz após a hidroperoxidação lipídica que ocorre durante o processo de fotossensibilização das espécies. (1) DOUGHERTY, Thomas J. Activated dyes as antitumor agents. Journal of the National Cancer Institute, v. 52, n. 4, p. 1333-1336, 1974. (2) HAKLI, zgül et al. Photodynamic anti-inflammatory activity of meso aryl substituted porphyrin derivative on mammalian macrophages. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 45, p. 103922, 2024. (3) XU, Tao et al. Quaternary ammonium cations conjugated 5, 15-diaryltetranaphtho (2, 3) porphyrins as photosensitizers for photodynamic therapy. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 267, p. 116228, 2024.

Câncer, Células escamosas, Queratinócitos, Terapia Fotodinâmica, Tetraazoporfirinas

Since the first report by Thomas J. Dougherty in 1974 (1), photodynamic therapy (PDT) has evolved significantly and is now a established medical protocol recognized by various regulatory agencies. Currently, PDT is prescribed for the treatment of several conditions, including various types of cancer, diabetic foot, ulcers, inflammatory acne, and macular degeneration, among others (2). The procedure involves the use of a photosensitizer (PS) capable of generating reactive species upon activation by visible light in the presence of oxygen. These reactive species oxidize biomolecules, ultimately leading to cell death (3). During the photosensitization process, membrane lipids are primary targets of oxidation, as cellular and organelle membranes represent the initial barrier to molecular entry. A previous study demonstrated that two porphyrazines (Pzs), containing 3-trifluoromethylphenyl (3-CF3Pz) and 4-fluorophenyl (4-FPz) substituents, exhibited similar efficiencies in generating reactive species. However, they showed markedly different efficiencies in permeabilizing model membranes. This discrepancy suggests that one of the compounds may possess specific properties that enhance cellular damage, although the exact mechanism remains unclear. In this context, the main objective of this thesis is to compare the photodynamic efficiencies of 3-CF3Pz and 4-FPz by identifying the types of radical species and products formed during the lipid photooxidation process. For this purpose, the Pzs were incorporated into liposomes composed of 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), and soybean phosphatidylcholine (SOY 95%) at a concentration of 0,5 mol% PS. The samples were then irradiated using various red light sources, depending on the specific experimental setup. Reactive species were detected using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, while lipid photooxidation products were characterized via mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Photodynamic efficiency was also assessed in both model membranes, the membrane leakage assays monitored by fluorescence and in vitro, using MTT cell viability assays with HaCaT and A-431 cell lines. Additionally, conformational and spatial characterization of the compounds within the lipid bilayers was performed using molecular dynamics simulations in GROMACS. When encapsulated in liposomes, 3-CF3Pz exhibited significantly higher phototoxic activity against the A-431 tumor cell line (IC50 = 0.23 uM) compared to 4-FPz (IC50 = 0,83 uM), despite EPR data showing no substantial difference in reactive oxygen species production. These findings align with the membrane leakage assay results, where 3-CF3Pz induced 96% membrane permeabilization after 30 minutes of irradiation, in contrast to only 16% for 4-FPz. ESI-MS analysis revealed that both Pzs produced similar amounts of hydroperoxidized lipids. However, chromatographic data indicated that 4-FPz was more efficient at generating fatty acids, whereas 3-CF3Pz produced a signal corresponding to a lipid aldehyde an oxidation product known to promote membrane permeabilization. Molecular dynamics simulations further supported the experimental results: 4-FPz predominantly localized in the hydrophilic region of the lipid bilayer, favoring fatty acid formation, while 3-CF3Pz diffused into the lipophilic core, where lipid unsaturations are concentrated. According to existing literature, oxidative reactions at these unsaturated sites can lead to carbon chain cleavage and the formation of membrane pores, which likely accounts for the greater phototoxic efficiency observed for 3-CF3Pz. In conclusion, there is a significant difference in phototoxicity between the two Pzs, potentially attributable to the formation of short-chain lipid species, such as lipid aldehydes. This effect appears to result from the distinct localization and reactivity of 3-CF3Pz within the membrane during the photosensitization-induced lipid hydroperoxidation process. (1) DOUGHERTY, Thomas J. Activated dyes as antitumor agents. Journal of the National Cancer Institute, v. 52, n. 4, p. 1333-1336, 1974. (2) HAKLI, zgül et al. Photodynamic anti-inflammatory activity of meso aryl substituted porphyrin derivative on mammalian macrophages. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 45, p. 103922, 2024. (3) XU, Tao et al. Quaternary ammonium cations conjugated 5, 15-diaryltetranaphtho (2, 3) porphyrins as photosensitizers for photodynamic therapy. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 267, p. 116228, 2024.

Cancer, Keratinocytes, Photodynamic Therapy, Squamous cells, Tetraazoporphyrins