Dissertações

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Ana Clara Silva Granja

Adolfo Henrique de Moraes Silva

Estudo do Mecanismo de Interação do Complexo Ctnc-swctni por Espectroscopia de Rmn

Binding Mechanism Of The Ctnc-swctni Complex Investigated By Nmr Spectroscopy

Química

Físico-Química, Biofísica e Química Computacional

 

11/02/2026

Auditório II - Aluísio Pimenta

10:00

Prof. Adolfo Henrique de Moraes Silva - Orientador (Dr. (UFMG))
Prof. Guilherme Augusto Piedade de Oliveira - Coorientador (Dr. (UFRJ))
Profa. Ana Paula Canedo Valente (Ph.D. (UFRJ))
Prof. Jarbas Magalhães Resende (Dr. (UFMG))

A troponina C (cTnC), a subunidade ligante de Ca⁺ do complexo de troponina cardíaca (cTn), é um componente essencial da maquinaria sarcomérica responsável pela regulação da contração muscular e da geração de força. No estado ligado ao Ca⁺, a cTnC adota predominantemente uma conformação fechada, semelhante à sua forma apo. Entretanto, após a ligação da região switch da troponina I cardíaca (swcTnI, resíduos 147-163), o domínio N-terminal da cTnC sofre uma transição conformacional para um estado aberto, expondo um sítio hidrofóbico fundamental para o processo de reconhecimento molecular. Ainda não está claro se essa conformação aberta pré-existe em equilíbrio conformacional com a conformação fechada e é seletivamente reconhecida pelo peptídeo (seleção conformacional), ou se ela é gerada como consequência da ligação do peptídeo (ajuste induzido). A elucidação desses mecanismos de reconhecimento molecular é central para a compreensão da função biomolecular da cTnC. O objetivo deste trabalho é investigar a dinâmica conformacional e o mecanismo de ligação da interação cTnC-swcTnI por meio de espectroscopia de RMN de alta resolução combinada com modelagem cinética quantitativa. Especificamente, buscou-se determinar se a seleção conformacional, o ajuste induzido ou um mecanismo híbrido descreve de forma mais adequada o processo de ligação. Além disso, pretende-se quantificar os parâmetros cinéticos e termodinâmicos que governam essa interação, estabelecendo uma base mecanística com resolução estrutural e dinâmica. Inicialmente, espectros de H-⁵N HSQC da cTnC marcada com H e ⁵N foram adquiridos na presença de concentrações crescentes do peptídeo swcTnI não marcado, com o objetivo de monitorar variações de deslocamento químico (chemical shift perturbations, CSPs) e identificar os resíduos envolvidos na ligação. Para as mesmas amostras, experimentos de dispersão de relaxação H extreme-CPMG (ECPMG) foram realizados a fim de monitorar processos de troca conformacional na escala temporal de microssegundos a milissegundos. As alterações no ambiente químico induzidas pela titulação do peptídeo foram mapeadas por meio da análise de CSPs, enquanto os experimentos de dispersão de relaxação permitiram avaliar variações nas taxas de troca conformacional em função da concentração do ligante. Os dados de dispersão de relaxação obtidos em cada concentração foram ajustados globalmente a um modelo cinético de quatro estados que incorpora tanto a seleção conformacional quanto o ajuste induzido. Os ajustes foram realizados utilizando scripts em MATLAB baseados na solução numérica das equações de Bloch-McConnell. Adicionalmente, foi realizada uma análise cinética do sistema para quantificar as contribuições relativas de cada via ao longo de uma faixa de concentrações do ligante, permitindo uma interpretação quantitativa do balanço entre ajuste induzido e seleção conformacional. Os espectros de H-⁵N HSQC apresentaram comportamento consistente com um regime de troca rápida a intermediária na escala de tempo da RMN, evidenciado por variações nos deslocamentos químicos e nas larguras de linha. A análise de CSPs revelou que resíduos localizados no domínio N-terminal da cTnC, particularmente aqueles que compõem a região hidrofóbica e hélices adjacentes, foram os mais afetados pela ligação do peptídeo. Além disso, mudanças nos deslocamentos químicos também foram observadas em resíduos distantes do sítio de ligação direto, sugerindo que a interação com o peptídeo induz alterações estruturais de longo alcance, consistentes com comunicação alostérica. Simulações e ajustes dos sinais de RMN dos espectros de H-⁵N HSQC foram utilizados para estimar a constante de dissociação e a taxa de dissociação da interação cTnC-swcTnI. Os experimentos de ECPMG confirmaram a presença de troca conformacional ao longo de toda a série de titulação do peptídeo. O ajuste global das curvas de dispersão de relaxação ao modelo de quatro estados demonstrou que um mecanismo que incorpora simultaneamente seleção conformacional e ajuste induzido fornece a descrição mais adequada da interação. Os parâmetros cinéticos extraídos da análise revelaram que a dissociação a partir do conformero aberto é aproximadamente duas ordens de magnitude mais lenta do que a dissociação a partir do conformero fechado, indicando uma estabilidade substancialmente maior do estado aberto ligado ao peptídeo. Em conjunto, esses resultados sugerem que o peptídeo swcTnI não apenas estabiliza a conformação aberta da cTnC, mas também reduz a barreira energética associada à transição conformacional. Ao elucidar a paisagem cinética e termodinâmica do reconhecimento cTnC-swcTnI, este trabalho contribui para uma compreensão mais aprofundada da regulação do músculo cardíaco e oferece insights mais amplos sobre sinalização alostérica, plasticidade conformacional e mecanismos dinâmicos de reconhecimento molecular.

Dinâmica de proteínas, Interação proteína ligante, RMN, Troponina C

Troponin C (TnC), the Ca⁺-binding subunit of the cardiac troponin (cTn) complex, is a critical component of the sarcomeric machinery that regulates muscle contraction and force generation. In its Ca⁺-bound state, cTnC predominantly adopts a closed conformation that closely resembles its apo form. Upon binding to the switch region of cardiac troponin I (swcTnI, residues 147-163), however, the N-terminal domain of cTnC undergoes a conformational transition to an open state, exposing a hydrophobic patch that is essential for molecular recognition. Whether this open state pre-exists in conformational equilibrium and is selectively bound by the peptide (conformational selection), or is generated only upon peptide binding (induced fit), remains unresolved. Elucidating the mechanism of molecular recognition is central to understanding biomolecular function. The aim of this work is to investigate the conformational dynamics and binding mechanism of the cTnC-swcTnI interaction using high-resolution NMR spectroscopy combined with quantitative kinetic modeling. Specifically, we sought to determine whether conformational selection, induced fit, or a hybrid mechanism best describes the binding process. In addition, we aimed to quantify the kinetic and thermodynamic parameters governing this interaction in order to establish a mechanistic framework with structural and dynamic resolution. Initially, H-⁵N HSQC spectra of H-, ⁵N-labeled cTnC were acquired in the presence of increasing concentrations of unlabeled swcTnI peptide to monitor chemical shift perturbations (CSPs) and identify residues involved in binding. For the same samples, H extreme-CPMG (ECPMG) relaxation dispersion experiments were performed to monitor conformational exchange processes on the microsecond-to-millisecond timescale. Peptide-induced changes in the chemical environment were mapped through CSP analysis, while relaxation dispersion experiments enabled the evaluation of changes in conformational exchange rates as a function of ligand concentration. Relaxation dispersion data obtained at each concentration were globally fitted to a four-state kinetic model incorporating both conformational selection and induced fit. The fits were performed using MATLAB scripts based on the numerical solution of the Bloch-McConnell equations. In addition, a kinetic analysis of the system was carried out to quantify the relative contributions of each pathway over a range of ligand concentrations, allowing a quantitative interpretation of the balance between induced fit and conformational selection. The H-⁵N HSQC spectra exhibited behavior consistent with a fast-to-intermediate exchange regime on the NMR timescale, as evidenced by changes in both chemical shifts and linewidths. CSP analysis revealed that residues located in the N-terminal domain of cTnC, particularly those forming the hydrophobic region and adjacent helices, were most strongly affected by peptide binding. Furthermore, chemical shift changes were also observed in residues distal to the direct binding site, suggesting that peptide interaction induces long-range structural changes consistent with allosteric communication. Simulations and fitting of the H-⁵N HSQC NMR signals were used to estimate the dissociation constant and dissociation rate of the cTnC-swcTnI interaction. The ECPMG experiments confirmed the presence of conformational exchange throughout the entire peptide titration series. Global fitting of the relaxation dispersion curves to the four-state model demonstrated that a mechanism incorporating both conformational selection and induced fit provides the most accurate description of the interaction. The kinetic parameters extracted from the analysis revealed that dissociation from the open conformer is approximately two orders of magnitude slower than dissociation from the closed conformer, indicating substantially greater stability of the open, peptide-bound state. Taken together, these results suggest that the swcTnI peptide not only stabilizes the open conformation of cTnC but also lowers the energetic barrier associated with the conformational transition. By elucidating the kinetic and thermodynamic landscape of cTnC-swcTnI recognition, this work contributes to a deeper understanding of cardiac muscle regulation and provides broader insights into allosteric signaling, conformational plasticity, and dynamic mechanisms of molecular recognition.

NMR, Protein dynamics, Protein-ligand interaction, Troponin C